在分子生物学的研究当中,分子与分子之间的互作关系是极其重要的课题,而在这其中,蛋白质与 RNA 分子的互作则是为转录水平调控以及转录后调控创造了丰富的可能性。 

RIP-seq,全称 RNA Immunoprecipitation Sequencing,该技术从一种已知的蛋白质出发,使用针对该蛋白的特异性抗体将目标蛋白以及与其结合的 RNA 复合物沉淀下来, 进而对富集到的 RNA 进行分离和建库测序,从而揭示 蛋白质-RNA 之间的结合关系。 

RIP-seq 拥有广泛的应用场景,例如:通过针对 AGO2 蛋白的 RIP-seq,可以获取参与 RNA 干扰以及 miRNA 海绵机制的相关 RNA 的信息;通过针对特定 RNA 修饰酶的 RIP-seq,可以知晓该 RNA 修饰酶的靶位点;通过针对特定 RBP(RNA 结合蛋白)的 RIP-seq,可以获知 RBP 结合并调控的靶基因…… 由于其在分子机制研究上的出色表现,RIP-seq 已经成为高分论文的利器。 

RIP 实验的成败是决定测序数据质量的关键因素。云序生物经过多年的经验积累,自研开发了商业化的 Genseq RIP 试剂盒,为 RIP 实验的成功率和稳定性保驾护航。云序生物实验室也承接 RIP-seq 以及 RIP-qPCR 业务,提供从样品处理,文库制备,上机测序到数据分析的一站式技术服务,助力复旦大学医学院、上海交通大学医学院、中科院上海植物生理生态研究所、华南农业大学动物科学学院在内的诸多研究机构的客户发表了十余篇 RIP-seq 论文,其中不乏登上 Nature 子刊、Cell 子刊的高水平研究。

以下几篇精彩案例不容错过:

案例 1 

论文标题:Hypoxia regulates overall mRNA homeostasis by inducing Met1-linked linear ubiquitination of AGO2 in cancer cells

发表期刊:Nature Communications (IF=17.694)

作者单位:上海交通大学医学院

样品类型:人类 HeLa 细胞系

详细解读:RIP-seq项目文章|nature子刊揭示低氧诱导AGO2线性泛素化调控肿瘤发生发展机制 

miRNA 对 mRNA 的表达沉默作用需要 AGO2 蛋白的介导。在常氧和缺氧两种环境下,作者针对 AGO2 蛋白进行了 RIP-seq 实验,揭示了缺氧处理对 AGO2 结合的 mRNA 的影响。累积分数分析显示,缺氧显着降低了 mRNA 与 AGO2 的相互作用。通过包括 miRNA 测序在内的一系列后续实验,作者发现缺氧诱导 AGO2 与 HOIP 以及 HOIL-1L 等的相互作用,它们与 miRNA 诱导的沉默复合物(miRISC)共定位,进而催化 AGO2 蛋白发生 Met1 残基连接的泛素化(AGO2 M1-Ubi )。通过 RIP-seq 结果与 mRNA-seq  结果的比较,作者证实 AGO2 M1-Ubi 机制可以降低本应受 miRNA 调控的靶 mRNA 与 AGO2 的结合,从而造成 mRNA 的积累。 

案例 2

论文标题:Translational Regulation of Plant Response to High Temperature by a Dual-Function tRNAHis Guanylyltransferase in Rice

发表期刊:Molecular Plant (IF=21.949)

作者单位:中科院上海植物生理生态研究所

样品类型:水稻种子

详细解读:云序客户再发高分文章,教你如何玩转tRNA机制研究

作者通过包括  tRNA-seq  在内的一系列实验,发现 tRNAHis 表达量的异常,进而发现一个 tRNAHis 的鸟苷酸转移酶 AET1,它有助于 pre-tRNAHis 的修饰,并且对水稻在高温条件下的正常生长不可或缺。作者随后针对 AET1 蛋白进行了 RIP-seq,发现了 208 种 mRNA 在高温条件下与 AET1 蛋白结合。RIP-seq 的聚类热图显示植物生长素相关基因存在明显的组间差异,其中 OsARF 基因最为明显。作者随后进行了 RIP-qPCR 验证,确认了高温环境下 AET1 蛋白与 OsARF 基因的主要开放阅读框(mORF)以及上游开放阅读框(uORF)均存在结合。作者随后还进行了翻译组水平的一些实验,证明 AET1 通过 tRNA 影响水稻植物生长素信号相关蛋白的表达。这些发现为AET1通过在tRNA修饰和翻译控制中发挥双重作用来调控水稻的环境温度反应的分子机制提供了新的见解。

 案例 3

论文标题:SUMOylation of YTHDF2 promotes mRNA degradation and cancer progression by increasing its binding affinity with m6A-modified mRNAs

发表期刊:Nucleic Acids Research(IF= 19.16)

作者单位:上海交通大学医学院

样品类型:人类肺癌细胞系

详细解读:云序客户余健秀课题组m6A方向再次取得重大发现——SUMO化促进YTHDF2结合m6A修饰的mRNA影响癌症进展

RNA m6A 修饰的阅读蛋白 YTHDF2 在体内和体外的主要部位K571被SUMO化,它可以被缺氧诱导,而被氧化压力和SUMO化抑制剂减少。YTHDF2的SUMO化对其泛素化和定位的影响不大,但会大大增加其与m6A修饰的mRNA的结合亲和力,随后导致基因表达的失调,这也是癌症发展的原因。此外,来自TCGA数据集的肺腺癌患者的无病生存分析显示,YTHDF2的高表达和SUMO1的高表达预示着不良的预后。此项研究揭示了YTHDF2识别m6A-RNAs的一个新的调节机制,并强调了YTHDF2的SUMO化在转录后基因表达调节和癌症进展中的重要性。

案例 4

论文标题:The RNA binding protein SORBS2 suppresses metastatic colonization of ovarian cancer by stabilizing tumorsuppressive immunomodulatory transcript

发表期刊:Genome Biology(IF= 17.906)

作者单位:四川大学华西医学院

样品类型:人类卵巢癌细胞系

详细解读:叕一篇!云序客户高分文章,教你如何巧用RIP测序玩转分子机制!

本文揭示了RNA结合蛋白SORBS2在卵巢癌肿瘤细胞转移过程中的重要生物学作用。从数据库搜索,到通过RIP-seq锁定SORBS2靶基因,RIP-seq 联合全转录组测序的相关生物信息学分析提示SORBS2结合并稳定部分转录本,其中WFDC1和IL-17D作为SORBS2结合的重要靶点可以抑制卵巢癌细胞的转移灶的定殖。相关结果提出了一个全新的连接癌症发展和免疫调节的转录后调控网络,这一网络依赖于SORBS2结合并稳定转录本的重要生物学作用。

案例 5

论文标题:Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition

发表期刊:RNA Biology (IF= 4.766)

作者单位:华南农业大学动物科学学院

样品类型:鸡肝脏组织

详细解读:云序手把手教您如何应用RIP和RNA pull down技术——研究RNA分子互作机制冲击高分文章

这篇文章主要研究circRNA Vav3通过吸附gga-miRNA-375促进鸡肝癌的EMT过程,也是运用了RIP-PCR和RNA pull down-PCR实验探究了circRNA Vav3能够吸附gga-miRNA-375的机制

案例 6

论文标题:Attenuation of Piwil2 induced by hypoxic postconditioning prevents cerebral ischemic injury by inhibiting CREB2 promoter methylation

发表期刊:Brain Pathology(IF=7.611)

作者单位:广州医科大学

样品类型:大鼠脑组织

详细解读:用户文章,1区 | 新型非编码RNA piRNA测序揭示脑缺血神经损伤机制

作者在本文中描述了 Piwil2在通过表观遗传机制调节 CREB2表达和介导大鼠 tGCI (短暂全局性脑缺血)后 HPC (低氧后处理)的神经保护中的作用。HPC 下调了 tGCI 后 CA1区域中 Piwil2的表达,作者通过针对 Piwil2 蛋白的 RIP +  piRNA-seq  发现了组间差异 piRNA 共同调控的基因:DNA 甲基转移酶 DNMT3A。DNMT3A 反过来消除了 tGCI 诱导的 CREB2启动子甲基化的增加,从而增加了 CREB2在 mRNA 和蛋白质水平。此外,HPC 诱导的 Piwil2的减少起到了恢复树突复杂性和树突长度的作用,并阻止了 CA1区域神经元树突棘的丧失,从而改善了 tGCI 后大鼠的学习和记忆功能。

RNA免疫沉淀(RIP)技术介绍

01 RIP实验原理

RIP技术(RNABinding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀),是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络的有力工具。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析,结合的RNA可以通过定量PCR(RIP-PCR)或高通量测序(RIP-seq)方法来鉴定。

02 RIP-seq技术简介

这种技术运用针对目标蛋白的抗体把相应RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP-Seq将RIP技术与高通量测序相结合,能够高通量地检测与特定蛋白结合的RNA,从而解析全转录组范围内的目标蛋白-RNA相互作用网络。云序生物是业内少数的既做前端高通量测序筛选,同时实现一站式解决功能机制的科研服务公司。在各RNA分子研究火热的现阶段,更多科研工作者想要在通过高通量筛选到目的基因后,解决RNA的分子机制问题,云序提供的RIP和RNA pull down技术正好解决分子机制的核心技术难点。

03 RIP试剂盒

GenSeq(R)RNA免疫沉淀试剂盒(RIP试剂盒),应用于RNA-蛋白质互作研究。通过RIP方法,可以检测与特定蛋白结合的RNA,从而为研究分子机制提供强势助力。优化过的实验流程后获得的蛋白结合RNA可以广泛应用于后续的定量RT-PCR,高通量测序以及其他检测分析。

 云序生物服务优势 

优势一:一站式服务,客户只需提供细胞,组织RIP后 RNA,云序生物为您完成从样品处理,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程。

优势二:商业化的RIP试剂盒RIP实验的成败是决定数据质量的关键,云序生物采用商业化RIP试剂盒,保证了RIP实验的成功率和稳定性。

优势三:严格的质控,云序生物在实验的各个关键步骤加入了一系列质控点,全程监控实验质量,确保客户得到优质的数据。

优势四:专业化的生物信息分析,云序生物具有强大的生物信息学团队,能够满足客户的各类深入数据分析要求。

相关产品 

根据已知分子和目标分子的不同,常见的蛋白质-RNA 互作研究的实验方法有如下几种类型:

RIP-seq

RNA-Pull Down

CO-IP

双荧光素酶验证Label free蛋白质谱TMT 蛋白质谱

RNA-seq

mRNA-seq

miRNA-seq

mRNA-qPCR

miRNA-qPCR

RIP试剂盒

 云序客户RIP文章列表 

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